Charlotte Reiniger est née le 2 juin 1899 à Berlin : elle découvre, enfant, les théâtres de marionnettes chinoises et développe déjà une fascination pour ce mode d'expression. Adolescente, sa passion est alimentée par la découverte du cinéma et de ses possibilités : les courts-métrages de Georges Méliès et Paul Wegener la font rêver..
Elle rejoint rapidement la troupe de Max Reinhardt d'où est issu Paul Wegener : elle devient rapidement chargée des silhouettes et autres cartons dans les films de ce dernier. Son travail avec le réalisateur sur Le Joueur de flûte de Hamelin, en 1918, fait sa réputation dans le petit milieu du cinématographe.
C'est en 1926 qu'elle propose son premier long-métrage, Les Aventures du Prince Ahmed. La critique est unanime, aussi bien pour la réalisation que pour la prouesse technique. Deux ans plus tard, Reiniger se tourne à nouveau vers l'adaptation avec celle des romans pour la jeunesse Docteur Dollitle. Malheureusement, son film muet et mis en musique est quelque peu éclipsé par l'apparition du cinéma parlant...
Assistant à la montée du nazisme, Reiniger et Carl Koch décident de quitter l'Allemagne, mais passent les années suivantes à voyager de pays en pays, puisqu'aucun ne leur cède de visas. Malgré tout, ils bouclent 12 films entre 1933 et 1944, dont nombre d'adaptations comme Galatea (1935) et Le Chat botté (1936), ainsi qu'un certain nombre d'opéras.
Après un détour par Berlin à la fin de la Seconde Guerre mondiale, le couple s'installe à Londres : Reiniger y fonde la société de production Primrose Productions en 1953. Elle réalise encore de nombreux films, notamment pour la BBC et Telecasting America, dont des adaptations des contes de Grimm.
Lotte Reiniger meurt à Dettenhausen, en Allemagne, à l'âge de 82 ans, le 19 juin 1981.